易基因：中国农大田见晖教授团队揭示DNA甲基化保护早期胚胎线粒体基因组稳定性｜项目文章

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在早期哺乳动物胚胎中，线粒体氧化代谢增强是着床后生存和发育的重要特征；着床前期的线粒体重塑是正常胚胎发生的关键事件。在这些变化中，氧化磷酸化（OXPHOS）增强对于支持着床后胚胎的高能量需求至关重要，但线粒体氧化代谢的增强，同时也导致线粒体内大量ROS的积累，由此产生的线粒体氧化应激会破坏早期胚胎线粒体DNA（mtDNA）稳定性。在围植入期，尽管多种抗氧化机制会被激活以清除细胞内大量的ROS，但线粒体内部是否存在对抗氧化应激的自我保护机制，一直都不清楚。同时线粒体基因组在此过程中发生DNA甲基化，它与线粒体应激增强的时空重合，那mtDNA甲基化是否在维持线粒体基因组稳定性方面发挥作用呢？

近期，中国农业大学动物科学技术学院动物繁殖与发育科学系岳媛博士和任立坤博士为论文共同第一作者、田见晖教授和安磊教授为论文共同通讯在美国科学院院刊（PNAS）正式发表了题为“Mitochondrial genome undergoes de novo DNA methylation that protects mtDNA against oxidative damage during the peri-implantation window“的研究论文，研究揭示了早期胚胎通过线粒体DNA de novo甲基化（de novo mtDNA methylation）保护线粒体基因组稳定性的全新机制。

标题：线粒体基因组经历从头DNA甲基化，保护mtDNA在围植入期免受氧化损伤。

期刊：P NATL ACAD SCI USA（PNAS）

影响因子：IF 9.4 / Q1

易基因为本研究提供DNA甲基化分析技术服务

本研究团队发现线粒体基因组经历了mtDNA从头甲基化，可以保护mtDNA免受着床前窗口期间氧化增强的损伤。线粒体基因组在在由囊胚向附植后胚胎发育的过程中，发生广泛的mtDNA甲基化，从而在囊胚的低甲基化状态中建立相对高甲基化的mtDNA。机制研究表明，DN甲基转移酶3A（DNMT3A）和DNMT3B在这个过程中进入线粒体并通过特异性线粒体定位序列（MTS）与mtDNA结合。功能丧失和获得实验表明，DNMT3A和DNMT3B负责协同催化mtDNA从头甲基化。最后，通过体内和体外实验进行验证，结果证实了增加的mtDNA甲基化功能可以保护线粒体基因组免受线粒体氧化应激增加诱导的mtDNA损伤，维持线粒体基因组稳定性。总的来说，本研究结果揭示了关键围发育期mtDNA甲基化动态及其潜在机制，并揭示了线粒体表观遗传重塑与代谢变化之间的功能相关性，证明了核基因组-线粒体在建立线粒体表观遗传学和维持线粒体稳态中的作用。

早期胚胎线粒体基因组保护机制模型

 

结果图形

（1）着床前期窗口期间mtDNA从头甲基化与线粒体氧化应激时空重叠。

使用甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq）分析小鼠E3.5囊胚、E7.5上胚层和E10.5胚胎的mtDNA甲基化模式，这些时间点代表核基因组DNA从头甲基化的发育窗口。

图1：着床前窗口期间mtDNA从头甲基化与线粒体氧化应激的时空重叠。

1. 比较E3.5和E7.5胚胎的总ATP（adenosine triphosphate）水平(左)、OXPHOS依赖性ATP产生（中）和相对贡献（右）。
2. E3.5和E7.5胚胎的线粒体膜电位。右侧通过定量红色(JC-1聚集体)：绿色(JC-1单体)荧光比例来测量线粒体膜电位。
3. MitoSOX(一种特异性线粒体探针)检测E3.5和E7.5胚胎内线粒体ROS荧光图像。右侧:定量检测内线粒体ROS水平。
4. MeDIP-seq检测小鼠线粒体基因组在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中的甲基化谱。y轴显示每500bp MeDIP-reads的归一化富集。在线性化mtDNA图谱下方的注释显示mtDNA元件的位点。
5. 基于三个发育阶段的MeDIP富集评分，对线粒体基因组的所有区间进行热图分析。右侧：E3.5时不同平均富集评分的三个子类的mtDNA甲基化动态。
6. 具有相对高（≥2.6%，HCP）、中等（>1.2%且<2.6%，ICP）或低（≤1.2%，LCP）CpG密度的三个子类别区间的mtDNA甲基化动态。
7. 在三个发育阶段具有不同富集评分的富集区间比例。
8. 使用MeDIP-qPCR检测着床前期连续发育阶段选定区域的相对甲基化水平，包括重链和轻链蛋白编码基因（Nd5, Nd6）、非编码基因（12s）以及调控区域（D-loop）。数据表示三个重复的平均值±标准差。*P < 0.05，**P < 0.01。

 

(2) DNMT3A和DNMT3B在发育过程中进入到线粒体中并催化mtDNA从头甲基化。

图2：DNMT3A和DNMT3B在发育过程中进入到线粒体中并催化mtDNA从头甲基化。

A-B. 在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中，对TOM20标记的线粒体（环状横截面）与DNMT3A（A）或DNMT3B（B）的互作进行高质量3D显微重建超分辨率免疫荧光分析。

C. 利用金耦联抗体通过免疫电子显微镜检测E7.5胚胎中DNMT3A和DNMT3B的线粒体定位。

D.在E9.5和E10.5胚胎的纯化线粒体中对DNMT3A和DNMT3B进行Western Blot分析。

E-F. 在着床前期选定区域的DNMT3A-mtDNA（E）和DNMT3B-mtDNA（F）物理互作ChIP分析。 G. MeDIP-qPCR检测野生型、Dnmt3a−/−和Dnmt3b−/− E10.5胚胎的选定区域相对甲基化水平。

 

（3）DNMT3A和DNMT3B含有促进高效线粒体易位的功能性MTS

图3：DNMT3A和DNMT3B含有促进高效线粒体转移的功能性线粒体定位序列（MTS）。

A-B. DNMT3B（A）和DNMT3A（B）的MTS中代表性α-螺旋结构（红色）及其相应残基（红色文字）的带状模型。

C-D. 在E3.5、E7.5和E10.5胚胎中，通过RT-PCR从成熟转录本中扩增出能够编码DNMT3A（C）和DNMT3B（D）的MTS的琼脂糖凝胶电泳。

E. 利用预测的DNMT3A和DNMT3B的MTS介导EGFP在线粒体中的转移，这些EGFP被瞬时转染到NIH/3T3细胞中。

 

（4）mtDNA从头甲基化功能保护线粒体基因组免受氧化损伤。

图4：mtDNA从头甲基化保护线粒体基因组免受氧化损伤。

A-B. 在野生型、Dnmt3a−/−和Dnmt3b−/−着床后胚胎中，对长距离区域内（A）和选定区域内（B）的mtDNA损伤进行定量检测。

C. 线粒体靶向共表达Dnmt3a和Dnmt3b，以及单独过表达Dnmt3a或Dnmt3b，对NIH/3T3细胞选定区域内相对甲基化水平的影响。

D. 线粒体靶向共表达Dnmt3a和Dnmt3b，以及单独过表达Dnmt3a或Dnmt3b，对保护NIH/3T3细胞中mtDNA免受H2O2诱导的氧化损伤的影响。

参考文献：

Yue Y, Ren L, Zhang C, Miao K, Tan K, Yang Q, Hu Y, Xi G, Luo G, Yang M, Zhang J, Hou Z, An L, Tian J. Mitochondrial genome undergoes de novo DNA methylation that protects mtDNA against oxidative damage during the peri-implantation window. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jul 26;119(30):e2201168119. doi: 10.1073/pnas.2201168119. PubMed PMID: 35858425.

 

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