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妊娠期间饮酒是导致儿童神经发育障碍的主要原因之一，高剂量饮酒可导致儿童出现认知、行为和神经发育障碍，但目前对于低至中等饮酒水平的影响尚不完全清楚。DNA甲基化是一种表观遗传机制，涉及在碳-1代谢过程中向胞嘧啶碱基添加甲基基团，可能影响基因表达的组织特异性和发育适当性。产前酒精暴露（prenatal alcohol exposure，PAE）可以通过表观遗传机制，如DNA甲基化，干扰胎儿基因调控。
近日，澳大利亚Telethon儿童研究所（Telethon Kids Institute）的David Martino团队在《eLife》杂志发表题为“Early moderate prenatal alcohol exposure and maternal diet impact offspring DNA methylation across species”的科研成果。研究采用全基因组重亚硫酸盐测序 （WGBS） 对新生儿大脑和肝脏（两个受乙醇影响的靶器官）中的 CpG DNA 甲基化进行无偏倚评估，并对先前研究中已确定对早期中度 PAE 敏感区域进行靶基因检测。研究结果表明常见的饮酒模式可以对胎儿基因调控产生可检测的影响，突出了母体饮食支持在公共卫生干预中的作用。
标题：Early moderate prenatal alcohol exposure and maternal diet impact offspring DNA methylation across species（早期中度产前酒精暴露和母体饮食影响不同物种子代的DNA甲基化）
期刊：eLife
影响因子： IF 6.4 / 1区
技术平台：WGBS（易基因优势技术）
研究采用生理相关小鼠模型来模拟人类妊娠期间常见的早期中度产前酒精暴露（PAE），发现早期中度PAE足以影响新生儿的位点特异性DNA甲基化，在成年同胞中不改变其行为结果。对新生儿的大脑和肝脏进行全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS），揭示了对DNA甲基化的随机影响，其影响主要表现出组织特异性，其中一些影响可能早在原肠胚形成阶段就开始了。DNA甲基化差异在具有调控潜力的非编码基因组区域中富集，表明酒精对基因组调控有广泛影响。研究还发现在小鼠模型中，富含叶酸和胆碱的母体饮食可以保护新生幼崽避免早期中度PAE对DNA甲基化的伤害。在患有胎儿酒精谱系障碍（FASD）的人类队列中的复制研究表明，一些效应在与疾病相关表征的相关基因上稳定，包括面部形态、智力、教育成就、自闭症和精神分裂症。本研究研究表明，即使在没有明显表型变化的情况下，早期中度PAE也足以影响胎儿基因组调控，强调了预防性母体饮食干预的作用。
研究方法
- 使用小鼠模型模拟人类妊娠期间的早期中度PAE。
- 对新生小鼠的大脑和肝脏进行全基因组亚硫酸盐测序（WGBS），以评估DNA甲基化。
- 比较暴露于PAE小鼠和未暴露小鼠之间的甲基化差异。
- 研究了富含叶酸和胆碱的母体饮食对DNA甲基化的影响。
- 在人类队列中复制小鼠模型中鉴定出的PAE敏感区域。
结果图形
（1）各处理组的产前表征比较
为研究早期中度PAE和富含甲基供体（HMD）饮食在妊娠期间对子代DNA甲基化和行为结果的影响，作者采用包含四个处理组的小鼠模型（H2O-NC组、PAE-NC组、H2O-HMD组、PAE-HMD组），旨在评估酒精暴露与对照组小鼠相比对子代DNA甲基化的影响（图1）。
图1：产前酒精暴露（PAE）模型概述
实验设计的示意图。每个处理组15只雌鼠。PAE小鼠从怀孕前一周开始至妊娠第8-10天，暴露于乙醇（PAE），其余小鼠则接受水（H2O）。PAE和H2O组从怀孕前一周至出生，接受正常食物（NC）或高甲基供体（HMD）食物（NC含有20mg/kg叶酸和4970mg/kg胆碱）。
图2：产前酒精暴露（PAE）和高甲基供体饮食（HMD）对雌鼠表型的影响：
- 采用无交互作用的二次混合效应模型分析显示HMD显著影响雌鼠体重增长进程，而PAE无显著影响。
- 二次混合效应模型分析全妊娠期液体消耗轨迹受PAE和HMD影响，PAE和HMD与妊娠期显著交互作用。
(c-d) 非配对t检验或方差分析（ANOVA）窝仔数（N=40）（c）和幼崽性别比（N=36）(d)与PAE或HMD没有显著关联。
图3：PAE和HMD对小鼠表型的影响：
(a-b) 在第1-17天（a）和第1-19天(b)之间，各处理组的平均体重增加没有显著差异。
- 给予补充食物的小鼠在整个妊娠期间显著消耗了较少总量的液体。条形图显示了每个处理组的均值和标准差。每个点代表一只雌鼠。
- 雌鼠在妊娠期间消耗的食物轨迹因添加处理而显著变化（n=36）。
（2）早期中度PAE对新生小鼠组织DNA甲基化的影响
图4：没有证据表明产前酒精暴露（PAE）会导致整体甲基化失调。
该图显示了在不同调控基因组环境中CpGs甲基化水平平均值。无论是大脑组织（a和b）还是肝脏组织（c和d），都没有受到PAE暴露（蓝色条）的显著影响。条形图表示均值和标准差。
图5：PAE与子代DNA甲基化的位点特异性差异相关。 在给予正常食物（NC）的小鼠大脑（a）和肝脏（b）中，大多数差异甲基化区域（DMRs）在PAE下甲基化丢失。每个点代表一个DMR，点颜色表示PAE下DNA甲基化变化。PAE还与NC小鼠大脑（a）和肝脏（b）中鉴定的Impact基因启动子区域DMRs甲基化降低相关。在大脑（e）和肝脏（f）中鉴定的DMRs在基因间和CpG间区域富集，而在CpG和基因区域中缺乏。条形图将全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）DMRs的数量（红色）与一组等效的随机生成区域（蓝色）进行比较。（g）肝脏DMRs的GO分析显示在神经元细胞组分和生物过程中富集。BP/红色点=生物过程，CC/蓝色点=细胞组分。
表1：大脑和肝脏中的DMR基因内含子区域鉴定的差异甲基化区（DMR）表。
表2：与组织特异性调节区域重叠的大脑和肝脏差异甲基化区域（DMR）数量和百分比
（3）HMD可以减轻早期中度PAE对DNA甲基化的影响
图6：高甲基供体（HMD）部分减轻了产前酒精暴露（PAE）对子代DNA甲基化的影响。
在正常食物（NC）小鼠中，观察到一些大脑（a）和肝脏（b）的DMRs在PAE下平均DNA甲基化效应大小超过30%。在HMD小鼠中，PAE甲基化绝对差异均值在大脑（a）和肝脏（b）中有所降低。每个点代表一个DMR，点颜色表示PAE导致的DNA甲基化变化。如果位于基因区域内，具有高CpGs和甲基化差异的点用相关基因进行注释。HMD与大脑（e）中靠近12号染色体上Lamb1的DMR甲基化增加和肝脏（f）中靠近17号染色体上Socs5的DMR甲基化减少相关。
（4）早期中度PAE和HMD对成年小鼠行为结果的影响
图7：产前酒精暴露（PAE）对其他评估的行为结果没有显著影响。
在焦虑行为方面，PAE和高甲基供体饮食（HMD）没有显著影响，这通过非配对t检验在（a）开放场测试中在内区的百分比时间（N=104）和（b）高架十字迷宫测试中在开放臂的百分比时间（N=85）中没有显著差异来证明。在空间识别方面，PAE和HMD没有显著影响，这通过非配对t检验在（c）物体识别（N=108）和（d）物体位置测试（N=98）中的辨别指数没有显著差异来证明。在运动协调和平衡方面，PAE和HMD没有显著影响，这通过非配对t检验在（e）第一次转棒测试（N=112）和（f）第二次转棒测试（N=87）中的时间没有显著差异来证明。
图8：高甲基供体饮食（HMD）与运动活性增加相关。
与正常食物（NC）相比，HMD与运动活性增加相关，这通过非配对t检验在（a）开放场测试（N=104）、（b）物体识别测试（N=108）、（c）高架十字迷宫测试（N=88）和（d）物体位置测试（N=98）中显著增加的总行进距离来表明。
（5）人类PAE和胎儿酒精谱系障碍（FASD）病例对照队列的复制研究
图9：在小鼠模型中鉴定的七个产前酒精暴露（PAE）DMRs在Lussier等人2018年的人类胎儿酒精谱系障碍（FASD）队列中成功复制。
两个PAE DMRs的例子，它们在Lussier等人2018年的队列中与FASD的临床诊断相关，DNA甲基化显著降低（a和c），而它们在小鼠模型实验中的liftover DMR也显示出与PAE相关的DNA甲基化显著降低（b和d）。
表3：在小鼠模型中鉴定的DMR在Lussier等人2018年的人类病例对照队列中验证了FASD的临床诊断
关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向：
WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）
- 全基因组甲基化图谱课题
- 标志物筛选课题
- 小规模研究课题
技术优势：
- 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
- 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
- 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。
参考文献：
Bestry M, Larcombe AN, Kresoje N, Chivers EK, Bakker C, Fitzpatrick JP, Elliott EJ, Craig JM, Muggli E, Halliday J, Hutchinson D, Buckberry S, Lister R, Symons M, Martino D. Early moderate prenatal alcohol exposure and maternal diet impact offspring DNA methylation across species. Elife. 2024 Sep 6;12 pii: 92135. doi: 10.7554/eLife.92135. PubMed PMID: 39239947.
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