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DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，参与动物细胞分化、胚胎发育、基因组印记和性染色体失活等生物学过程。随着DNA甲基化测序变得越来越复杂，用它来解决更多的动物学问题成为可能。2023年11月5日，华南农业大学动物遗传育种与繁殖系聂庆华教授团队在《J Anim Sci Biotechnol》（IF:7/1区）杂志发表综述，综述了DNA甲基化特征，重点介绍了DNA甲基化在家禽中的研究与应用。
背景介绍（Introduction）
分子遗传标记技术的成熟使畜禽数量性状图谱稳健、系统和完善，为畜禽改良提供了新的手段。DNA甲基化是一种应用广泛的表观遗传学修饰。DNA甲基化导致某些基因活性抑制，而去甲基化则诱导基因重新激活和表达。在DNA甲基转移酶的催化作用下，DNA中CG的两个核苷酸被选择性地添加甲基，形成5mC，其主要出现在5'-CG-3'基因序列中。大多数脊椎动物基因组DNA含有少量甲基化C，主要分布在基因5'端的非编码区，并以簇的形式存在。
DNA甲基化已在家禽物种中广泛应用。例如，在肉鸡的DNA甲基化图谱中，基因组中有更多的低甲基化区域，且在基因启动子区域分布最多的是CGIs（CpG岛），表明CGIs甲基化和肌肉发育相关基因的低甲基性参与肉鸡肌肉的快速发育。同时，MyH1 AS，一种存在于DMRs（差异甲基化区域）中的lncRNA（长链非编码RNA），参与调节鸡胚胎肌肉的发育。在骨骼肌卫星细胞的DNA甲基化研究中，Wnt信号通路在KEGG数据库和GO分析中显著富集，且启动子区甲基化状态影响了Wnt5a、Wnt9a和TGFβ1基因的表达水平，表明Wnt和TGFβ信号的甲基化状态是骨骼肌发育过程中的关键调控因子。这些标记对了解家禽重要经济性状的分子调控机制和遗传表达机制，促进家禽遗传育种具有重要意义。
随着测序技术的不断发展，DNA甲基化表观遗传学研究已在生物学、医学、农林等领域得到广泛研究。基因组层面的大量研究增加了对畜禽重要经济性状遗传机制的理解，减少了养殖中疾病和遗传缺陷的发生，为提高家禽的生产效率、产品质量和经济效益做出了重要贡献（图1）。通过对家禽DNA甲基化的相关研究内容的回顾，我们进一步了解了DNA甲基化在家禽生产中的作用，这可能提供一定的理论依据。
图1：家禽表观遗传机制概述
DNA甲基化在家禽繁殖性状中的应用
Gallus Gallus(家鸡)是世界上最重要的商业肉类来源，然而，关于鸡表观遗传学的研究较少。鸡遗传资源保护的一个重要问题是抑制鸡的近亲繁殖。
目前常用的表观遗传学DNA甲基化研究测序方法包括MeDIP-Seq （甲基化DNA免疫沉淀测序）、MBD-Seq（甲基DNA结合域测序）和WGBS（全基因组DNA甲基化测序）。然而，很少有研究用这些测序方法对鸡生殖相关组织进行测序。研究了DNA甲基化对鸡繁殖性能的影响，并发现了一些关键的分子标记。对强近交系和弱近交系狼山鸡（Langshan chicken）进行WGBS测序分析，分别在下丘脑和卵巢中鉴定出5948和4593个DMRs。大量DMG (DMR相关基因)在生殖相关通路中富集。一项结合WGBS和转录组数据的研究结果表明，SRD5A1和CDC27基因中的两个DMRs可能是狼山鸡近交系繁殖抑制的生物标志物(图2a)。然而，对鸡DNA甲基化机制和DNA甲基化景观的分析表明，DNA甲基化的整体分布与哺乳动物相似，精子DNA表现出低甲基化，这与鸡基因组中DNMT3L辅因子缺失相关。此外该研究提供了其在转录因子结合位点的动态调控，并将这些信息应用于构建鸡DNA甲基化时钟，可以准确预测肉仔鸡的日龄 (图2b)。在人类医学和干细胞生物学中的一种重要新方法是体外产生生殖细胞。通过揭示单个基因的DNA甲基化模式，发现DNA甲基化精确调控的某些基因如AKT1和CTNNB1与癌症和病毒感染相关，还揭示了用于鉴定雄性生殖细胞的鸡特异性标记。重要的是，该研究探索了雄性生殖细胞分化的整合表观遗传机制(图2c)。
图2：DNA甲基化在家禽繁殖性状中的应用
- 通过对强近交系鸡的下丘脑和卵巢的DNA甲基化分析，在DMRs区域鉴定出可能抑制朗山鸡近交系的标记基因SRD5A1和CDC27。
- 虽然DNA甲基化的整体分布与哺乳动物相似，但精子DNA表现出低甲基化，这与鸡基因组中DNMT3L辅因子的缺失有关。建立了基于LMR分析的DNA甲基化时钟，用于肉鸡日龄预测。
- 鸡生殖细胞的全基因组DNA甲基化图谱。通过揭示单个基因的DNA甲基化模式，发现一些被DNA甲基化精确调控的基因与癌症和病毒感染相关，如AKT1和CTNNB1
DNA甲基化是连接基因和表型的纽带，已被广泛用于确定环境对家禽生长的影响。同时，DNA甲基化也在鸭子身上进行研究。
采用全基因组DNA甲基化检测方法，研究绍兴鸭繁育群体与保护群体DNA甲基化水平的差异。鉴定出35个差异甲基化基因，这些基因与生产性能密切相关。此外，与蛋壳质量相关的ATP2B1和ATP2B2基因也被鉴定为差异甲基化，可作为未来改善蛋壳质量的分子标志物。孵育温度对胚胎发育也有长期影响，通过在胚胎期(ED) 1-10、ED10-20和ED20-27将孵育温度从37.8ºC提高到38.8ºC，以研究其对DNA甲基化的影响。结果表明，甲基CpG结合域蛋白和DNA(胞嘧啶5)-甲基转移酶可能参与鸭早期胚胎发育的热成因调控（thermoe-pigenetic regulation)。
家禽肌肉发育过程中的DNA甲基化机制
肌内脂肪(Intramuscular fat，IMF)是影响肉质不可或缺的因素，受营养、环境和遗传的调节。DNA甲基化在早期肌肉发育中起关键作用。通过建立肌内脂肪细胞分化模型，有报道DNA甲基化通过调控COL6A1等基因影响IMF沉积，COL6A1调节肌内脂肪细胞形成(图3a)。在肌肉的早期发育过程中，DNA甲基化是一个不可忽视的重要因素。不同的研究发现，DMGs与肌动蛋白丝解聚、骨骼肌卫星细胞增殖和肌肉器官发育显著相关，而CFL2负调控鸡骨骼肌卫星细胞增殖并诱导细胞凋亡 (图3b)。
图3：DNA甲基化在家禽肌肉和脂肪发育中的作用机制
- DNA甲基化通过调控胶原、VI型和α1（COL6A1）等基因调控肌内脂肪形成，从而影响IMF沉积。
- 体外实验表明CFL2负调控鸡骨骼肌卫星细胞增殖并诱导细胞凋亡
DNA甲基化在家禽疾病发生中的作用
禽白细胞病病毒J亚组(Avian leukosis virus subgroup J, ALV-J)和肠炎沙门菌(沙门菌seroovar Enteritidis, SE)可通过影响家禽生产造成家禽行业严重的经济损失，并对公共卫生造成严重威胁。越来越多的疾病被证明与DNA甲基化变化相关。通过MeDIP-seq和RNA-seq测序研究，生成了ALV-J阳性和阴性鸡样本的全基因组基因表达和DNA甲基化图谱。通过整合分析筛选出6个候选基因，以鉴定启动子区域甲基化差异的ALV-J阴性鸡(图4a)。分析鸡SE反应的全基因组DNA甲基化谱，揭示甲基化在鸡SE反应中的调控机制。接种SE可促进鸡盲肠DNA甲基化，引起免疫和代谢相关基因甲基化变化。包括miRNA和HOX基因家族在内的Wnt信号通路可能在鸡接种过程中的SE甲基化调控中发挥关键作用(图4b)。
图4：DNA甲基化在家禽疾病发生中的作用
- 通过MeDIP-seq分析鉴定ALV-J阳性和阴性鸡样本的DMRs，RNA-seq分析鉴定ALV-J阳性和阴性鸡样本的DEGs，提示TGFB2可能是识别ALV-J感染的指标。
- 接种SE可促进鸡盲肠DNA甲基化，引起免疫和代谢相关基因甲基化变化。Wnt信号通路、miRNA和HOX基因家族可能在鸡接种过程中SE甲基化调控中发挥关键作用。
CD8 (Cluster of differentiation 8)作为T细胞受体的辅助受体（co-receptor），在细胞表面呈递肽。CD8A转录由几个顺式和反式作用元件以及DNA甲基化调控。Xu等人研究了CD8A表达的DNA甲基化等表观遗传转录调控机制，发现鸭的CD8A mRNA水平与CD8A CpG总体甲基化状态呈负相关，提示CD8A高甲基化可能与鸭CD8A高甲基化和DHV-1感染有关。
铁蛋白重肽1 (Ferritin heavy polypeptide 1, FTH1)表达受多种病原体调控，但其调控机制仍不清楚。构建鸭肝炎病毒(DHV-1)感染模型，检测鸭感染DHV-1后FTH1 (duFTH1) mRNA的表达。采用亚硫酸盐测序法(BSP)检测duFTH1启动子区DNA甲基化水平，揭示该区域表现出低甲基化，同时，duFTH1启动子区存在影响该区域活性的突变，该突变改变了转录因子NRF1的结合位点。通过进一步分析验证了FTH1启动子与NRF1的结合情况。本研究为duFTH1表达通过启动子多态性而不是DNA甲基化对DHV-1攻击的影响提供了分子见解。
DNA甲基化如何影响家禽产蛋
产蛋是家禽的重要经济性状。了解影响鸡蛋生产的关键基因对育种者来说具有重要意义。
已有研究表明，饲喂VC(维生素C)对11胚龄(E11)肉鸡生产性能、免疫状态和DNA甲基化相关基因表达的影响。结果表明，E11时VC的IOF（in ovo feeding，鸡胚给养）改善了孵化后肉鸡的生产性能和免疫状态，并在一定程度上提高了肉鸡的抗氧化能力。酶相关DNA甲基化和去甲基化的表达提示VC组脾脏DNA甲基化水平可能升高，但抗炎和促炎细胞因子的表达波动是否与DNA甲基化变化有关，还有待进一步研究。
此外，还研究了ZP2基因启动子甲基化对静海黄鸡产蛋率的影响。通过构建ZP2基因缺失启动子载体，预测ZP2基因核心区位于-1,552~-1,348之间。ZP2基因启动子区mC-20、mC-21位点甲基化与mRNA表达呈负相关(P<0.05)。这两个位点均位于Sp1转录因子结合位点，可能会抑制Sp1与DNA的结合，从而影响ZP2基因的转录和产蛋。
DNA甲基化对鹅肝的影响
鹅肝是一种很受欢迎的美食。它含有大量的不饱和脂肪酸，具有独特的风味，深受世界各地消费者的喜爱。研究建立了对照组和过量喂养组，评估添加甜菜碱（betaine）对肝脏重量等指标的影响。结果表明，甜菜碱处理组鹅肝脏S14α mRNA表达水平高于对照组和过量饲喂组。使用亚硫酸盐(包含33个CpG二核苷酸)对该区域(相对于转录起始位点，在+374~-8碱基对之间)的单个等位基因进行测序。研究结果，过量喂养组S14α转录本表达增高，33个CpG位点平均甲基化率为87.9%。对照组S14α基因表达明显低于对照组(69.6%，P<0.01)。然而，甜菜碱处理组(82.6%)和过量喂养组(87.9%)鹅的转录起始位点甲基化水平没有显著变化。这些结果表明，添加甜菜碱后，S14α基因转录起始位点的DNA甲基化模式可能不依赖于S14α转录本表达。
C/EBP-β是肝脏脂质代谢平衡的关键调节因子之一。为进一步了解C/EBP-β对鹅肝脏脂质蓄积的影响，很少有研究克隆C/EBP-β的DNA。结果表明，甜菜碱不直接调控鹅体内C/EBP-β基因的甲基化，但降低了C/EBP-β基因表达。这些数据可为进一步研究C/EBP-β调节鹅肝脂肪代谢机制以及甜菜碱对脂肪代谢基因分子水平的影响奠定基础。
限制饮食蛋氨酸会影响生长性能和氨基酸代谢。用甜菜碱补充甲基供体可以防止这种干扰。研究饲粮中添加蛋氨酸和甜菜碱对蛋氨酸缺乏的鹅生长性能、表观遗传机制和转录组基因表达的影响。结果表明，饲粮中添加甜菜碱和蛋氨酸改变了鹅肝脏LOC106032502的DNA甲基化水平，影响了鹅的转录调控网络。
结论
本文主要对DNA甲基化在家禽的繁殖性状、肌肉和脂肪发育、疾病、产蛋等方面的影响进行综述。并介绍了一些重要的DNA甲基化标记物。DNA甲基化在家禽的生长、发育、环境和营养等多个方面发挥着重要作用。DNA甲基化通过调控基因表达影响真核细胞的发育和分化。大量研究利用DNA甲基化作为疾病鉴定和诊断的生物标志物、动物生长性状标志物、酮体性状标志物等(表1)。
表1：家禽DNA甲基化的主要标志物
但从现有的研究来看，鸭和鹅相关的DNA甲基化研究较少，而对鸡的研究较多。由于DNA甲基化的动态性和相对不稳定性等，目前的研究仍面临许多挑战，如某些疾病和动物组织样本的获得。因此很难建立稳定的DNA甲基化参考模型。随着DNA全基因组甲基化生物信息数据库的建立和DNA甲基化检测技术的发展，对家禽DNA甲基化的研究将越来越全面，更多的DNA甲基化标志物将被发现并应用到实际生产中，这些问题也将逐步得到解决。
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参考文献：
Ju X, Wang Z, Cai D, Bello SF, Nie Q. DNA methylation in poultry: a review. J Anim Sci Biotechnol. 2023 Nov 5;14(1):138. pii: 10.1186/s40104-023-00939-9.
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