摘要

学习和可塑性依赖于休息期间神经元回路的微调调节。一个尚未解决的难题是，在没有外部刺激或有意识努力的情况下，睡眠中的大脑如何协调神经元的放电率(FRs)以及神经回路内外的通信，以支持突触和系统巩固。利用颅内脑电图对人类海马体和周围内侧颞叶(MTL)区域进行多单元活动记录，结果发现在慢振荡(SO)上升状态的控制下，睡眠纺锤波为涟波(ripples)的发生设定了一个时间框架。这种顺序耦合导致(1)神经元FRs、(2)局部神经元集群之间的短潜伏期交叉相关性和(3)跨区域MTL相互作用的逐步增加。因此，由慢振荡(SOs)和纺锤波触发的涟波为脉冲时序依赖可塑性(spike-timing-dependent plasticity，STDP)和系统巩固建立了最佳条件。这些结果揭示了特定睡眠节律的顺序耦合是如何在人类睡眠期间协调神经元处理和通信的。

前言

短暂的经历是如何转化为持久的记忆的？睡眠是大脑的一种特殊状态，使其免受外部干扰和任务的影响，为记忆的形成重新组织和塑造神经元回路。从机制上讲，学习和可塑性受两个基本原则控制：突触巩固，即由短潜伏期共放电对局部回路的长时程增强(脉冲时序依赖可塑性(STDP))；系统巩固，即跨区域通信在海马体-皮层网络中传递记忆痕迹。目前，一个尚未解决的问题是睡眠中的大脑如何调节神经元(共)放电率(FRs)以促进这些形式的巩固。

啮齿类动物和人类电生理记录的研究结果表明，耦合的睡眠节律(即慢振荡(SOs)、纺锤波和涟波)在介导巩固过程中发挥着潜在作用。SOs反映了膜电位的波动(＜1Hz)，在去极化的上升状态和超极化的下降状态之间切换。纺锤波是12-16Hz的起伏振荡，通过丘脑-皮质相互作用产生和维持。涟波是一种短暂的高频脉冲(人类中约为80-120Hz)，在海马体中最为明显，但最近也在海马体外区域观察到。在人类内侧颞叶(MTL)中观察到了每一种节律，它们的相互作用与啮齿类动物记忆巩固的行为表达有关，在人类中的类似发现仅限于通过头皮脑电图(EEG)测量到的SO-纺锤波相互作用。

重要的是，目前尚不清楚这三种睡眠节奏的相互作用是否以及如何调节神经元活动以支持突触和/或系统巩固。在协调局部和跨区域的神经元相互作用时，SOs、纺锤波和涟波之间的分工是什么？在动物模型中，同一动物和记录会话中MTL和高级皮质区域的全面覆盖数据很少见。在人类中，来自非侵入性电生理记录(MEG和EEG)的数据仅限于SOs和纺锤波，而对深层源的定位仍然具有挑战性。癫痫患者的颅内EEG(iEEG)允许记录MTL及其之外的SOs、纺锤波和涟波，但通常仅限于与神经元放电间接相关的场电位。为了克服这些局限性，本研究使用深度电极记录了在自然睡眠期间接受术前监测的癫痫患者的MTL。这些电极可以捕捉神经元的放电(多单元活动(MUA))，使我们能够评估内源性睡眠节律在调节局部和跨区域神经元活动中的作用。

方法

参与者和记录

为了治疗药物难治性癫痫，本研究对10名(5名男性，5名女性，均为右利手，平均年龄为39.9岁(范围20-62岁))接受侵入性术前癫痫发作监测的参与者进行了20次以上(每个参与者1-4个sessions)的宏电极和微电极记录。本研究未使用统计方法来预先确定样本量，但本研究的样本量与以前出版物中报告的样本量相似。这项研究获得了波恩大学医学机构审查委员会的批准，参与者提供了书面知情同意书。所有参与者双侧植入深度电极，分别位于海马体前后、杏仁核、内嗅皮层和海马旁皮层(图1a)。使用ATLAS系统(Neuralynx)放大来自微电极的差分信号，滤波范围为0.1~9000Hz，采样率为32kHz。

图1.实验设计示意图。

伪迹拒绝和事件检测

在MATLAB(版本R2022a)中使用FieldTrip(版本20201229)函数进行数据分析。在睡眠事件检测之前，对每个接触点进行预处理和伪迹检测。预处理包括降采样至1kHz，通过±1Hz带阻滤波器去除50Hz的线噪声和高达200Hz的谐波，以及使用0.1Hz的高通滤波去除慢信号漂移。iEEG信号是倒置的，因此正峰值反映上升态。对于伪迹检测，本研究创建了原始信号的两个副本：一个在应用250Hz的高通滤波器后创建，另一个在对数据进行一阶导数(反映信号梯度)后创建。在每个睡眠阶段内对三个信号(原始信号、高通滤波信号、梯度信号)进行z标准化，如果三个信号中的任何一个z值超过6，或者原始信号以及其他两个信号(高通滤波信号，梯度信号)中的z值均为4，则将该数据点归类为伪迹。将间隔＜3 s的伪迹合并，并在伪迹样本的两侧另外增加1s的填充。

SOs、纺锤波和涟波是基于先前的方法进行算法检测的。简言之，对于SO的检测，首先将信号进行0.3-1.25Hz的带通滤波。其次，在滤波后的信号中确定所有过零点，并将SO事件持续时间确定为两个连续的正到负过零点之间的时间（即，一个下降状态后紧跟着一个上升状态）。持续0.8到2秒的事件进入下一步。第三，确定其余的SO事件振幅。两个振幅均超过所有事件的均值加上1个标准差的事件被视为SO。SO锁定分析是基于事件开始(正到负的过零点或上升到下降状态转变的位置)、事件中心(开始后的最大波谷，即下降状态)或事件最大值(开始后的最大峰值，即上升状态)。

纺锤波检测采用12-16Hz的带通滤波，并基于200ms的窗口计算均方根(RMS)信号，然后使用相同窗长进行平滑处理。当平滑的RMS信号超过一个阈值(即所有NREM数据点上RMS信号的均值加上1个标准差)，持续至少0.4s但不超过3s，则被认为是一个纺锤事件。超过由RMS信号的均值加上9倍标准差的时间点被排除。最后，纺锤波需要在原始iEEG信号中表现出至少六个周期。纺锤波的起始(开始)和截止(结束)分别定义为平滑RMS信号的向上和向下阈值交叉点。除非另有说明，否则纺锤波的中心被定义为最大波谷。

涟波的检测遵循相同的程序，只是iEEG信号是进行80-120Hz的带通滤波，并且RMS计算和平滑都基于20ms窗口。检测阈值和上限阈值分别由RMS信号的均值加上三倍和九倍标准差来定义。持续时间＜38ms或＞200ms的潜在涟波事件被拒绝。此外，所有涟波事件都需要在原始EEG信号中表现出至少三个周期。除非另有说明，否则涟波中心被定义为最大波谷。

结果

捕获SOs、纺锤波和涟波的场电位来自最内侧的宏观接触点(双极重参考后)。分析侧重于非快速眼动(NREM)睡眠(N2和N3阶段；有关睡眠图示例和睡眠阶段的比例，请参见图1b和补充表1)。对SOs、纺锤波和涟波进行算法检测。结果事件的总平均值如图1c所示。请注意，双极重参考后的SO振幅比双侧乳突参考后的SO振幅小；然而，在不同的重参考方案中，检测到的事件的形态和数量是可比较的。

SOs、纺锤波和涟波的顺序耦合

为了确定SOs、纺锤波和涟波的时间耦合关系，首先将纺锤波和涟波中心与SOs进行时间锁定，发现了两种事件类型都嵌套在SO的上升状态中(图2a，左)。重要的是，在有纺锤波存在时(相同时间窗)，SO锁定涟波(即SO下降状态±1秒内发生的涟波)的发生率显著高于无纺锤波的情况(P＜0.001；图2a，右)。为了更详细地揭示SOs、纺锤波和涟波之间的时间动态关系，本研究使用事件开始而不是事件中心进行重复分析。如图2b(左)所示，纺锤波开始时间在SO上升状态的较早阶段增加，而涟波开始时间在纺锤波之后。事实上，纺锤波和涟波的峰值平均发生在−451ms处和−241ms处。

图2.SOs、纺锤波和涟波的顺序耦合。

为了直接测试纺锤波是否会增加涟波发生的可能性，本研究提取了涟波中心、起始(开始时间)和截止(结束时间)相对于纺锤波中心、起始和截止的发生情况。图2c证实了纺锤波中心周围涟波率的显著增加，揭示了涟波发生在纺锤波中心之前的趋势(即，在“增强”阶段；P＜0.001，-1~0s与0~1s)。图2d所示的开始和结束锁定分析证实，耦合到纺锤波的大多数涟波在纺锤波起始后开始，在纺锤波结束前结束。通过直接比较纺锤波开始前后250ms窗口与纺锤波结束前后250ms窗口的涟波率，进一步证实了这一观察结果。总之，这些结果表明，纺锤波和涟波聚集在SO的上升状态中，纺锤波增加了涟波在其开始和结束时间之间发生的可能性。

神经元FRs在SOs、纺锤波和涟波中增加

接下来，将探讨SOs、纺锤波和涟波是否以及如何调节神经元的FRs。请注意，先前对人类的研究已经报道了SOs、纺锤波和(清醒)涟波对FRs的调节，但这些FRs之前没有在相同的参与者、脑区和行为状态(例如睡眠)中进行过对比研究。如图3a(来自海马体的单个神经元示例)和3b(MUA在接触点中汇集并在会话中平均)所示，所有三种事件类型都以不同的方式调节相对于事件前的基线间隔FRs。在SOs期间，FRs在上升状态时增加，在下降状态时显著减少，表明了SO下降状态具有主动抑制功能(FRs低于基线水平)。在纺锤波期间，FRs在纺锤波中心周围增加，并在中心前后500ms降低，这可能反映了耦合SO下降状态的影响(图2a)。最后，FRs在涟波期间有明显的增加，在涟波开始前有大约500ms的逐渐上升期。为了量化SOs、纺锤波和涟波中FRs的逐步增加，本研究计算了每个会话中三个事件中心±2s内的最大FRs。如图3c所示，从SOs到纺锤波(P=0.040)和从纺锤到涟波(P＜0.001)的最大FRs显著增加。请注意，本研究根据先前的研究选择了事件前基线间隔，但当使用不同的间隔或匹配的非事件替代物时，结果保持不变。

图3.SOs、纺锤波和涟波对神经元(协同)FRs的调节。

SOs、纺锤波和涟波期间的神经元协同放电

如上所述，推动细胞集群中与学习相关变化的一个核心机制是短潜伏期协同放电，能够通过STDP诱导长时程增强。最近的一份报告显示，外侧颞叶皮层中的纺锤波在神经元之间协同放电25ms，但这种效应与SOs和涟波期间的潜在协同放电的关系尚不清楚。为了考察SOs、纺锤波和涟波期间的协同放电模式，本研究提取了以事件最大值为中心的±50ms窗口内的互相关图(CCGs)。对于给定束中的所有微导线对，计算并生成CCGs(产生对称的CCGs)，仅包括在所有NREM睡眠中显示最低FR(1Hz)的导线。接下来，对得到的CCGs分两步进行校正。首先，减去“偏移预测因子”CCGs，这反映了事件n期间导线1的 FR与事件n+1期间导线2 FR的互相关，从而说明了特定事件类型期间的总体FRs。其次，减去从匹配的非事件替代物中获得的CCGs。因此，在最终的CCGs中，大于零的值表示局部集群中高度特定于事件的协同放电。如图3d所示，所有三种事件类型都引发了显著的神经元协同放电。然而，值得注意的是，协同放电的时间窗在SOs、纺锤波和涟波中呈逐步减少的趋势。SOs的显著协同放电范围为35ms，纺锤波为28ms，涟波为5ms，第二个峰值在~9和15ms之间(反映了约70-110Hz的振荡周期)。图3d(右)中进一步突出显示了CCGs的逐步缩小，其中所有三个CCGs在每个会话中都在0和1之间缩放。总之，这些发现表明，涟波最适合创造有利于STDP的条件。

FRs与事件发生之间的关系

涟波期间FRs的显著增加(图3b)引发了一个问题，即SO和纺锤波相关的FRs是否可能仅反映与涟波相关的FRs，因为涟波与SOs和纺锤波耦合在一起(图2a)。相反，在SOs和纺锤波期间，真正的FR增加可能会通过调节涟波前的逐渐上升而触发涟波的发生(在涟波中心前约500ms开始；图3b)。为了在这两种情况之间做出判断，本研究首先再次进行了事件锁定FR分析，但根据是否存在另一种事件类型(例如，涟波，“目标”)来分离感兴趣的事件类型(如，纺锤波，“种子”)。通过算法检测发生在种子事件中心±1s内的目标事件中心来粗略定义是否存在。如图4a所示，当存在涟波时，SOs和纺锤波的FRs都增加了(反之亦然)。然而，重要的是，当不存在涟波时，SO上升状态和纺锤波中心周围的FRs也显著增加。这一结果表明，涟波并不是SOs和纺锤波期间FR增加的(唯一)驱动因素。

图4.神经元FRs与事件发生之间的关系。

为了回答第二个问题，即SO和纺锤波相关的FRs是否可以预测涟波的发生，分别在每个会话中计算了每个参与者十个MTL接触点的种子事件FRs和目标事件发生之间的时间相关性。换言之，在纺锤波期间显示更大FRs的触点是否也显示出更大的纺锤波锁定涟波率？然后，通过非参数聚类置换检验对得到的相关图(n=20)进行零检验。如图4b所示，SO上升状态期间的FRs与SO锁定的纺锤波发生率之间没有关联。然而，SO上升状态下的FRs与SO锁定的涟波发生率呈正相关。这种关系对于纺锤波中心周围的FRs和纺锤波锁定的涟波发生率更为明显。与SO上升状态(~500 ms)相比，纺锤波期间较窄的调制窗口可能反映了FRs(~100 ms)的瞬态增加(图3b)。关键是，在对角线下方可以看到显著的相关性，即较早的SO和纺锤波FRs预测了较晚的涟波发生率。总之，这些结果表明，涟波的出现至少在一定程度上是由SO和纺锤波引起的FRs逐渐增加所促进的。

与SOs、纺锤波和涟波相关的MTL网络动态

最后，系统巩固依赖于超越局部细胞集群的区域间信息传递。因此，本研究着眼于SOs、纺锤波和涟波在不同MTL区域之间的交互作用(前后海马、杏仁核、内嗅皮层和海马旁皮层；图5a)。请注意，该数据集使用了双极参考，从而降低了容积传导效应的影响。

图5.网络动态。

首先，本研究评估了跨区域事件发生的程度，即当在区域A(种子区域)中检测到涟波时，在区域B(目标区域)中也发生涟波的可能性。所有同侧半球的接触对组合在一起(得到对称的直方图)，然后将目标事件发生率与事件前的基线间隔进行比较。如图5b所示，所有三种事件类型在MTL区域之间相互耦合。值得强调的是，对纺锤波和涟波种子事件的精确跨区域锁定，表明大多数其他纺锤波和涟波中心发生在同一周期或下一周期，从而优化了相互通信的条件。

为了证实并扩展跨区域通信的发现，本研究计算了成对锁相值(PLVs)，反映了不同事件中两个区域的一致相位差。这是以时间和频率分辨的方式完成的，以SOs、纺锤波和涟波为中心，并与事件前的基线进行统计比较。如图5c所示，该分析证实了所有三种事件类型在种子事件的频率范围内都引发了显著的PLVs。

最后，本研究评估了观察到的功能连接转化为神经元FRs跨区域调节的程度，例如，A区的涟波导致B区的FR增加。具体而言，本研究提取了每对同侧半球MTL接触点的目标区域中的基线校正FRs。MTL的连接强度如图5d所示。将所有连接边合并后，可以看到在SOs、纺锤波和涟波中跨区域FR调制的逐步增加(图5e)。总之，这些结果揭示了SOs、纺锤波和涟波在MTL区域之间存在功能耦合。这种耦合导致了神经元FRs(在涟波期间最强)的微调网络调制，可能非常适合支持系统层面的巩固过程。

结论

本研究结果阐明了SOs、纺锤波和涟波在睡眠期间协调神经元FRs和通信的机制，从而建立了有利于突触和系统巩固的条件。尽管最近的研究已经集中于这些睡眠节律的(共同)出现对记忆巩固的重要性方面，但它们在这一过程中的分工仍然不明确。本研究数据表明，SO上升状态首先建立了一个粗略的时间窗，使得纺锤波和涟波同时发生，这与先前的研究结果一致。重要的是，纺锤波增强了涟波发生的可能性，并为涟波的发生设定了更精细的时间框架，类似于纺锤波在SOs和涟波之间起到的中继功能。从机制上讲，本研究数据表明，SO上升状态以及纺锤波的上升期在更大程度上将FRs提高到一个能触发涟波信号的阈值。这导致了FRs呈指数级增长，并伴随着局部细胞集群和整个MTL的同步。综上所述，本研究发现在NREM睡眠期间，SOs、纺锤波和涟波系统地相互作用，以协调神经元FRs和通信。在SO上升状态的激发下，纺锤波增加了涟波发生的可能性。反过来，涟波又会导致神经元放电激增，并驱动局部集群中的短潜伏期共激活，从而为STDP和长时程增强创造有利的条件。最后，整个内侧颞叶(MTL)的睡眠节律是同步的，这促进了跨区域的神经元通信，并为系统巩固奠定了基础。

原文：Staresina, B.P., Niediek, J., Borger, V. et al. How coupled slow oscillations, spindles and ripples coordinate neuronal processing and communication during human sleep. Nat Neurosci (2023). https://doi.org/10.1038/s41593-023-01381-w