转录因子是细菌中调控基因表达的关键蛋白质，它们能够识别并结合到DNA的特定序列上，从而启动或抑制基因的转录。细菌ChIP-seq可以帮助我们理解细菌中转录因子的调控网络，揭示其在细菌生长、代谢和适应环境等方面的作用。这种技术对于研究细菌的基因调控机制和适应性演化具有重要意义。本期我们带来了一篇来自中山大学医学院团队发表在Nature communications上的ChIP-seq文章，研究探讨了2',3'-环状鸟苷酸单磷酸（2',3'-cGMP）如何通过转录调节因子RSp0980调控青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum的生物功能和毒力。

• 发表单位：中山大学医学院

• 发表期刊：Nature communications

• 发表日期：2023年11月10日

• 研究技术：ChIP-seq (His抗体）、RNA-seq、EMSA等

2023年11月10日，Nature communications杂志在线发表了中山大学医学院的研究论文“Regulation of the physiology and virulence of Ralstonia solanacearum by the second messenger 2′,3′-cyclic guanosine monophosphate”。该研究揭示了RSp0334的GGDEF结构域的不寻常功能以及细菌中2',3'-cGMP信号的特殊调节机制。爱基百客为该研究提供ChIP-seq的技术支持。

 研究背景 

此前研究发现双(3',5')-环二磷酸鸟苷单磷酸(bis-3',5'-c-di-GMP)在细菌中被广泛应用作为第二信使，用于调控细胞内的多种生物学功能。在该研究中，作者发现了2',3'-cGMP对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）中的重要生物功能、群体感知信号系统和毒力的调节作用，以及RSp0334和RSp0980在这一调节过程中的作用。这些发现为我们提供了对细菌中GGDEF结构域和2',3'-cGMP信号的特殊调节机制的深入了解。

 研究内容 

1. RSp0334在R. solanacearum中控制重要的生物功能

为了调查R. solanacearum中潜在的bis-3′,5′-c-di-GMP信号系统，研究对RpfR进行同源性搜索。选择了前9个同源物（按相似性排序）进一步研究，它们与RpfR的相似性在37.79%到42.63%之间。随后，研究构建了这9个同源物的缺失突变体。与R. solanacearum野生型菌株相比，RSp0254、RSp0334和RSp1155的缺失导致了运动活性分别降低了65.11%、70.22%和48%。此外，与野生型菌株相比，RSp0334突变株的生物膜形成减少了50.42%，而RSp0254和RSp1155突变株的生物膜形成分别增加了60.27%和39.17%。由于RSp0334的缺失破坏了R. solanacearum的生物膜形成和运动，因此选择其进行更深入的研究。

RSp0334的缺失对不同培养基中的细菌细胞生长几乎没有影响，但导致了运动、生物膜形成、纤维素酶产生和细胞外多糖（EPS）产生等表型的显著缺陷，而RSp0334的转录表达恢复了RSp0334缺失突变株的所有表型至野生型菌株的水平。

由于受测的表型受到吲哚丙酸信号和3-羟基棕榈酸甲酯（3-OH MAME）QS系统的控制，因此作者测试了RSp0334与这些信号系统之间是否存在关系。RT-qPCR和启动子-lacZ融合报告基因分析的结果显示，与R. solanacearum GMI1000野生型菌株相比，RSp0334突变株中phcB、solI和trpEG的表达水平显著降低。与这些结果一致的是，RSp0334突变株中3-OH MAME、N-辛酰-L-蛋氨酸内酯（C8-AHL）、N-癸酰-L-蛋氨酸内酯（C10-AHL）和吲哚丙酸的产量分别降低了78.13%、76.08%、72.74%和57.27%，而RSp0334的转录表达几乎完全恢复了这些信号的产量。

图1 RSp0334对毒力相关表型的影响。

2. RSp0334负调控R. solanacearum中的细胞内2′,3′-cGMP水平

由于RSp0334包含PAS-PAC-GGDQF-EAL结构域（图1b），作者继续研究其在环核苷酸分子代谢中的作用。HPLC分析显示，RSp0334的缺失导致细胞内未知分子水平显著增加，这种分子在转录表达中恢复到野生菌水平。由于这种分子的保留时间与标准的bis-3′,5′-c-di-GMP不同，因此从培养上清中分离和纯化了这种化合物。化合物的HR-ESI-MS分析显示该化合物可能具有C10H12N5O7P的分子式。最后，通过将NMR信息与2′,3′-cGMP进行比较，确认了从R. solanacearum中分离的化合物为2′,3′-cGMP，并且RSp0334突变株中的细胞内2′,3′-cGMP水平显著增加。

图2 RSp0334中关键酶活性位点的序列分析

3. RSp0334催化2′,3′-cGMP生成2′,3′-c-di-GMP

由于RSp0334负调控了R. solanacearum中的细胞内2′,3′-cGMP水平，作者假设它可能使用2′,3′-cGMP作为底物。为验证这一假设，通过亲和层析纯化了具有894个氨基酸和96 kDa计算分子量的RSp0334蛋白，并进行了体外酶活性实验。结果显示，在10分钟内，RSp0334蛋白催化了超过80%的2′,3′-cGMP，而该蛋白在体外不催化或降解2′,3′-cyclic adenosine monophosphate (2′,3′-cAMP)、GTP、bis-3′,5′-c-di-GMP或DNA。随后，作者纯化了产物，并通过HR-ESI-MS分析发现，产物的分子离子[M-H]-的m/z比为689.09003。在31P NMR谱图中，观察到产物具有两个化学位移（δ）为-1.20和-1.75的峰。这些结果表明，产物是一个环磷酸二鸟苷（cyclic di-GMP）。此外，在31P NMR谱图中存在两个明显的峰，表明产物是一个不对称的环磷酸二鸟苷，这一点也得到了1H NMR数据的支持。1H NMR谱图显示，化学位移（δ）为5.87、5.82、5.57、4.34、3.97、3.54和3.43的峰的积分值为1，这也证明了产物是不对称的，因为对称的bis-3′,5′-c-di-GMP应该具有均匀的积分值。因此得出结论，RSp0334将2′,3′-cGMP转化为2′,3′-c-di-GMP。

4. LLARLGGDQF基序催化2′,3′-cGMP生成2′,3′-c-di-GMP

由于RSp0334的GGDQF结构域催化2′,3′-cGMP生成2′,3′-c-di-GMP，而GGDEF结构域通常催化GTP生成bis-3′,5′-c-di-GMP，作者进一步研究了GGDQF结构域的详细功能。

为了测试Q549残基是否负责RSp0334的GGDQF结构域与bis-3′,5′-c-di-GMP合酶的GGDEF结构域之间的不同功能，生成了一个单点突变体RSp0334（GGDQF Q549E），其中残基Q549被谷氨酸（E）替换，将GGDQF结构域改变为GGDEF结构域。结果显示RSp0334（GGDQF Q549E）仍然表现出相同的催化2′,3′-cGMP的活性，但在将GTP转化为bis-3′,5′-c-di-GMP方面没有活性。

为了进一步探索GGDQF结构域的关键酶活性位点，作者生成了五种突变蛋白，突变了G546、G547、D548、Q549和F550这五个氨基酸残基。所有RSp0334（GGDQF）衍生物均通过亲和层析纯化，并用于体外酶活性实验。HPLC分析显示，只有Asp548的突变部分地减弱了RSp0334（GGDQF）的酶活性，而所有五个氨基酸残基的突变明显降低了RSp0334 GGDQF结构域的酶活性。RSp0334（GGDQF D548A）和RSp0334（AAAAA）的转录表达部分恢复了RSp0334缺失突变株的运动性和生物膜形成，使其恢复到野生型菌株的水平。

为了进一步确定RSp0334的酶活性是否需要其他氨基酸位点，作者与其他菌株的GGDEF结构域（GGEEF）的氨基酸进行序列比对。研究发现RSp0334具有Leu542和Leu545，这与两个bis-3′,5′-c-di-GMP DGCs中的残基不同。随后生成了突变蛋白RSp0334 L542A L545A D548A并测试了其酶活性。结果显示RSp0334 L542A L545A D548A对2′,3′-cGMP没有活性，并且RSp0334 L542A L545A D548A的转录表达不能恢复该突变体的生物膜形成和运动性，这表明L542、L545和D548三个氨基酸残基对RSp0334催化2′,3′-cGMP生成2′,3′-c-di-GMP的能力至关重要。

5. RSp0980是2′,3′-cGMP的受体，控制着RSp0334在R. solanacearum中调节的表型

作者在RSp0334缺失突变株中转录表达每个同源物，并测量转化菌株的运动性，发现只有RSp0980的转录表达才能恢复RSp0334突变株的运动性表型。因此，RSp0980被选定进行进一步研究。由于RSp0980的转录表达几乎完全恢复了RSp0334突变株的缺陷表型，继续研究RSp0980在调节重要的基础生物功能中的作用。作者构建了RSp0980的框内缺失突变，并发现RSp0980的缺失引起了与RSp0334突变株相同的表型变化，包括运动性、生物膜形成、EPS产生和纤维素酶产生，但不影响细菌在富营养或贫营养培养基中的生长速率。

图3 RSp0980对RSp0334突变菌株的毒力相关表型的影响

6. RSp0980通过直接结合启动子区域来调节靶基因的表达

作者在RSp0980突变株中构建了PphcB-lacZ、PsolI-lacZ和PtrpEG-lacZ报告系统，分别对应合成3-OH MAME、AHL和蒽醌酸的基因。与ΔRSp0334突变株类似，RSp0980缺失导致phcB、solI和trpEG的表达水平降低（图4a-c）。因此，作者测量并比较了野生型、RSp0980突变株和回补菌株中3-OH MAME、C8-AHL、C10-AHL和蒽醌酸信号的产量。结果显示，RSp0980突变株的3-OH MAME、C8-AHL、C10-AHL和蒽醌酸的产量减少，而在转录RSp0980的情况下，信号产量几乎完全恢复正常水平。

RSp0980含有一个HTH结构域，预计与DNA结合密切相关。因此，作者通过电泳迁移率变化实验（EMSA）测试了RSp0980是否通过直接结合其启动子来实现对phcB、solI和trpEG的转录调节。实验结果显示phcB、solI和trpEG启动子DNA片段与RSp0980形成稳定的DNA-蛋白复合物，并且迁移速度比未结合的探针慢。与RSp0980突变株中EPS的产生一致，RSp0980通过直接结合其启动子来调节epsA的表达。此外，作者纯化了RSp0980的HTH结构域和REC结构域，并发现随着HTH结构域的增加，与标记的探针结合的量也增加，而在REC结构域和探针之间没有形成DNA-蛋白复合物，这表明HTH结构域结合到了靶基因的启动子上。

为了进一步确认RSp0980是RSp0334介导的信号系统的一个关键下游调节因子，并阐明其潜在的调节机制，作者采用ChIP-seq来鉴定RSp0980直接调控的靶基因。在潜在的靶基因中，phcB、solI、trpEG和epsA与R. solanacearum的生物功能和致病性相关。ChIP-seq数据显示RSp0980结合了多个基因启动子，这些启动子含有潜在的RSp0980结合位点，被确定为5’-GGAAATGGAC-3’。然后分别从phcB、solI、trpEG和epsA的启动子区域中删除了潜在的结合位点5’-CCTGCCCGAC-3’、5’-GCAAATTCCG-3’、5’-CGAACCCGAC-3’和5’-GGAAGTCGCC-3’。EMSA分析显示，当从探针中删除结合位点时，DNA-蛋白复合物没有形成，这表明这些特定片段对于RSp0980与启动子的结合是必不可少的。综上所述，这些结果表明RSp0980通过直接结合基因启动子中的特定区域来调节靶基因的表达。

图4 RSp0980对QS信号系统的影响

7. 2',3'-cGMP消除了RSp0980与靶基因启动子DNA的结合

为了确定2',3'-cGMP与RSp0980的结合如何影响RSp0980的活性，作者通过EMSA检测了2',3'-cGMP对RSp0980与phcB、solI、trpEG和epsA启动子的结合效果。如图4所示，当混合物中存在2',3'-cGMP时，RSp0980与phcB、solI、trpEG和epsA启动子的结合受到抑制。随着2',3'-cGMP浓度的增加，与RSp0980结合的探针数量减少。与上述结果一致，外源2',3'-c-di-GMP或bis-(3',5')-c-di-GMP的添加并不影响RSp0980与epsA启动子的结合，而2',3'-cAMP在100μM时略微影响RSp0980与epsA启动子的结合，这表明RSp0980是2',3'-cGMP的特异效应物。

8. RSp0334/2',3'-cGMP/RSp0980信号系统控制着R. solanacearum的致病性和各种基因的表达

作者评估了RSp0334/2',3'-cGMP/RSp0980信号系统对R. solanacearum感染寄主植物的能力的影响。与被R. solanacearum GMI1000野生型菌株和回补菌株感染的植物相比，被RSp0334突变株和RSp0980突变株感染的植物出现了明显减少的萎蔫症状。接种21天后，接种野生型菌株、RSp0334补充菌株和RSp0980补充菌株的番茄植株的病情指数分别为4.0、3.8和3.8。RSp0334突变株和RSp0980突变株接种的植物的病情指数分别为3.0和2.7，分别比野生型菌株低25%和32.5%。

作者进一步量化了这些R. solanacearum菌株在番茄植株的根和茎中的菌落形成单位（CFU）值。接种后7天，R. solanacearum野生型菌株、RSp0334突变株、RSp0980突变株、RSp0334补充菌株和RSp0980补充菌株的CFU数分别为每克根组织2.45 × 109、9.32 × 105、2.21 × 107、5.18 × 108和4.12 × 108。在番茄茎上观察到类似的结果，这五种菌株在接种后7天的CFU数分别为每克茎组织9.13 × 109、1.93 × 106、1.09 × 107、1.51 × 109和1.16 × 109。这些结果表明，RSp0334/2',3'-cGMP/RSp0980信号系统在R. solanacearum的致病过程中发挥着重要作用。

图5 RSp0334和RSp0980对番茄植株中R. solanacearum致病性的影响

 小  结 

研究报告了关于细菌中第二信使2',3'-环鸟苷酸单磷酸(2',3'-cGMP)的研究成果。2',3'-cGMP通过转录调节因子RSp0980控制青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum中的重要生物功能、群体感知信号系统和毒力。此外，RSp0334的缺失导致细胞内2',3'-cGMP水平增加，从而改变了重要的表型。研究还发现，2',3'-cGMP、其受体以及具有LLARLGGDEF基序的进化的GGDEF结构域也存在于人类病原体沙门氏菌。这些发现揭示了RSp0334的GGDEF结构域的不寻常功能以及细菌中2',3'-cGMP信号的特殊调节机制。

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02 EMSA

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03 双荧光素酶报告实验

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