单细胞分析上游fasta文件处理
——基于cellranger与dropseqRunner
###如果测序文件由10X genomics平台产生，则采用cellranger count的基本流程进行fasta文件的上游处理；如果测序文件由dropseq平台产生，则采用dropseqRunner软件进行处理
一、cellranger配置
1、软件安装并查看帮助文档
#安装包下载
wget -O cellranger-7.1.0.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-7.1.0.tar.gz?Expires=1694703729&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cHM6Ly9jZi4xMHhnZW5vbWljcy5jb20vcmVsZWFzZXMvY2VsbC1leHAvY2VsbHJhbmdlci03LjEuMC50YXIuZ3oiLCJDb25kaXRpb24iOnsiRGF0ZUxlc3NUaGFuIjp7IkFXUzpFcG9jaFRpbWUiOjE2OTQ3MDM3Mjl9fX1dfQ__&Signature=YmIZ3TsEI7VxGNIY7SdL~8oH0jr7ktjMZ48HRiLDQfcYLN4YWcs5nk0CZeKkeemvygGK3VryeHnvZpA21r2jN2YKfSeAHC03t-aDKzjctzbPvnv9UbckvrOghyxW7mH14W7uzMJJ1C9PbBo869EDRH04vxfsYGFQONCxvb~iBamTU1ZJ-6etWVioLjzb7o4-Y3v4v46nw67qf2NaPTwNXr4PIA-vFdWe9v9YhQQM6VlHR8a5crTmaM39hGC~2PatW0qlEd-DsMHeeNb34~Gr5N8XNIHv6K1VcuMq8VobqLQKxeoz3obmA23~kWkPNOSZNCVXosd0p6Ok7fUHiVUt-Q__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA" &#解压文件
tar -zxvf cellranger-7.0.1.tar.gz
#把cellranger的路径加到$PATH中方便调用
vi ~/.bashrc
export PATH=”/data5/tan/zengchuanj/Software/cellranger-7.1.0/bin:$PATH”
echo 'export PATH=/data5/tan/zengchuanj/Software/cellranger-7.1.0/:$PATH' >> ~/.bashrc
#更新系统配置文件
source ~/.bashrc
#查看cellranger使用说明
cellranger count --help
2、参考基因组下载
#人类参考基因组数据集
wget -o human.log https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz &
tar -xvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz
#mouse参考基因组数据集下载
wget -o mouse.log https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz &
tar -xvf refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
#测试数据集下载
wget -o sample.log 'http://cf.10xgenomics.com/samples/cell-exp/2.1.0/neurons_900/neurons_900_fastqs.tar' &
tar -xvf neurons_900_fastqs.tar #解压
cellranger count --id=result --transcriptome=../refdata-gex-mm10-2020-A/ --fastqs=/neurons_900_fastqs --sample=neurons_900 --expect-cells=1000 --nosecondary
Attention：#count函数参数解释
cellranger count --id=sample \
--transcriptome=/opt/refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0 \
--fastqs=/home/scRNA/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
--sample=mysample \
--expect-cells=1000 \
--nosecondary
# id指定输出文件存放目录名
# transcriptome指定与CellRanger兼容的参考基因组
# fastqs指定mkfastq或者自定义的测序文件
# sample要和fastq文件的前缀中的sample保持一致，作为软件识别的标志
# expect-cells指定复现的细胞数量，这个要和实验设计结合起来
# nosecondary 只获得表达矩阵，不进行后续的降维、聚类和可视化分析(反正后续要走Seurat，为了节省计算资源，建议加上)
3、结果解读
Ref：https:/zhuanlan.zhihu.com/p/390516422
Outputs:
- Run summary HTML: /data5/tan/zengchuanj/pipeline/cellranger/result/outs/web_summary.html
- Run summary CSV: /data5/tan/zengchuanj/pipeline/cellranger/result/outs/metrics_summary.csv
- BAM: /data5/tan/zengchuanj/pipeline/cellranger/result/outs/possorted_genome_bam.bam
- BAM index: /data5/tan/zengchuanj/pipeline/cellranger/result/outs/possorted_genome_bam.bam.bai
- Filtered feature-barcode matrices MEX: /data5/tan/zengchuanj/pipeline/cellranger/result/outs/filtered_feature_bc_matrix
- Filtered feature-barcode matrices HDF5: /data5/tan/zengchuanj/pipeline/cellranger/result/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5
- Unfiltered feature-barcode matrices MEX: /data5/tan/zengchuanj/pipeline/cellranger/result/outs/raw_feature_bc_matrix
- Unfiltered feature-barcode matrices HDF5: /data5/tan/zengchuanj/pipeline/cellranger/result/outs/raw_feature_bc_matrix_h5.h5
- Secondary analysis output CSV: /data5/tan/zengchuanj/pipeline/cellranger/result/outs/analysis
- Per-molecule read information: /data5/tan/zengchuanj/pipeline/cellranger/result/outs/molecule_info.h5
- Loupe Browser file: /data5/tan/zengchuanj/pipeline/cellranger/result/outs/cloupe.cloupe
- outs/raw_feature_bc_matrix: 这个文件夹包含原始的基因表达矩阵，每一行代表一个基因，每一列代表一个细胞。这个矩阵中的值表示每个细胞中每个基因的表达水平。这个矩阵没有经过任何的标准化或过滤。
- outs/filtered_feature_bc_matrix: 这个文件夹包含经过过滤后的基因表达矩阵。在这个矩阵中，已经去除了低质量的细胞和低表达的基因。这是进行后续分析的主要输入。此文件夹包含三个文件：barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz和matrix.mtx.gz。这些文件包含了每个细胞的条形码、每个特征的名称和每个细胞中每个特征的计数。
- outs/metrics_summary.csv: 这个CSV文件包含了关于每个细胞和每个样本的一些质量控制指标，例如细胞计数、平均基因表达水平等。
- outs/web_summary.html: 这个HTML文件提供了一个交互式的可视化界面，用于查看分析的总结结果，包括细胞计数、质量控制指标、细胞类型聚类等。
- outs/cloupe.cloupe: 这是一个文件，可以用于在10x Genomics的Loupe浏览器中查看和分析单细胞数据。Loupe浏览器提供了丰富的数据可视化和分析功能。
二、dropseqRunner的配置
1、conda的安装
dropseqRunner是个依赖conda和python的环境，在安装前确保自己的服务器中有与之兼容的conda与python
wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/archive/Anaconda3-5.3.1-Linux-x86_64.sh
bash Anaconda3-5.3.1-Linux-x86_64.sh
2、Dropseq的安装
wget https://codeload.github.com/aselewa/dropseqRunner/zip/master
mv master master.zip
unzip master.zip
#创建dropseq运行的conda环境
conda env create -f environment.yaml
#每次运行dropseq前需要进行激活，不激活环境则无法调用snakemake
conda activate dropRunner
#编译，不编译无法出现主脚本
make
3、下载参考数据并构建比对索引
#这里以小鼠的为例
wget -o mm.log https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/001/635/GCF_000001635.27_GRCm39/GCF_000001635.27_GRCm39_genomic.fna.gz &
#安装处理gff文件软件
conda install gffread
#将gff文件转换为gtf文件
gffread GCF_000001635.27_GRCm39_genomic.gff -T -o mice.gtf
#建参考数据库
STAR --runThreadN 4 --runMode genomeGenerate --genomeDir reference/ --genomeFastaFiles GCF_000001635.27_GRCm39_genomic.fna --sjdbGTFfile mice.gtf
4、Dropseq使用方法
python /dropseqRunner-master/dropRunner.py --R1 SRR11799731_R1.fastq.gz --R2 SRR11799731_R2.fastq.gz --indices /dropseqRunner-master/db/reference --sample SRR11799731 --protocol drop
#主程序使用方法
#各个参数：
#R1 R2，分别是你的两个fastq文件
#--indices是刚才构建好的参考数据集
#--sample是样本前缀名
#运行完毕后用于Seurat的数据存在/sample/output/SRR11799731_0_Solo.out/Gene
三、Error自查
Attention error：主要是下载、安装、配置上的问题
1、 dropseqRunner下载问题
#下载dropseq
git clone git@github.com:aselewa/dropseqRunner.git
cd dropseqRunner
这个问题是关于使用Git克隆dropseqRunner时出现了权限拒绝错误。错误信息是“Permission denied (publickey)”。
这个错误通常是由于缺少SSH密钥或使用了错误的SSH密钥导致的。以下是一些可能的解决方法：
- 检查SSH密钥
在本地计算机上生成SSH密钥，并将公钥添加到GitHub帐户中。可以使用以下命令检查是否存在SSH密钥：
ls -al ~/.ssh
如果没有SSH密钥，请使用以下命令生成：
ssh-keygen -t rsa -b 4096 -C "your_email@example.com"
然后将公钥添加到GitHub帐户中。
- 使用HTTPS URL
使用HTTPS URL而不是SSH URL来克隆dropseqRunner。使用以下命令：
git clone https://github.com/aselewa/dropseqRunner.git
这将使用HTTPS URL克隆`dropseqRunner`，而不需要SSH密钥。
- 检查GitHub帐户权限
确保你的GitHub帐户具有克隆dropseqRunner的权限。如果您没有访问权限，请联系仓库的所有者以获取访问权限。
Ps：如果这些都解决不了，建议开始摆烂
- wget登场
wget https://codeload.github.com/aselewa/dropseqRunner/zip/master
之前以为Github仓库的master分支基本上应该是提交代码的记录，实际master是个二进制文件，后续发现实际应该是个.zip文件。
2、dropseqRunner配置问题
这一问题主要是因为environment.yaml下载错误，重新下载安装即可。
