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前列腺癌患者在接受雄激素受体信号抑制剂（ARSI）治疗后，可能会出现耐药性，导致治疗诱导的神经内分泌样前列腺癌（therapy-induced neuroendocrine-like prostate cancer,t-NEPC）发生。t-NEPC是一种高侵袭性亚型，具有小细胞样特征，对紫杉醇化疗具有耐药性，且总体生存率较差。t-NEPC的适应性神经特征是否是导致这种紫杉醇耐药性的原因尚不清楚。
2024年8月25日，美国内布拉斯加大学M. Jordan Rowley & Samikshan Dutta团队合作试图揭示t-NEPC的神经适应性特征是否与紫杉醇耐药性有关。研究团队通过分析患者基因表达数据库，并通过ATAC-Seq、乙酰化组蛋白ChIP-seq和RNA-seq等测序分析，探讨了Pax5作为转录因子在t-NEPC中的作用，以及其在神经内分泌样特征基因表达中的重要性。相关研究成果以“Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers“为题发表在Nature出版集团旗下刊物《Cell Death & Disease》上。
标题：Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers（Pax5在多西紫杉醇耐药性神经内分泌样前列腺癌发展中的作用）
发表期刊：Cell Death & Disease
影响因子：8.1 / 1区
技术平台：ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq等
本研究旨在理解Pax5在多西紫杉醇（多西他赛，docetaxel）耐药性神经内分泌样前列腺癌（t-NEPC）发展中的作用。首先，研究通过对患者基因表达数据库的通路分析表明，t-NEPC上调与增强细胞网络相关的多种神经通路。为鉴定可能对促进t-NEPC中神经特征基因表达重要的转录因子（TF），研究在NE样细胞系模型中进行了ATAC-Seq、乙酰化组蛋白ChIP-seq和RNA-seq测序，并分析了转录活跃且显著富集的神经内分泌样（NE样）癌特异性基因的启动子。分析结果表明，Pax5可能是一个对神经基因表达重要的转录因子，且在t-NEPC中具有特异性。通路分析揭示Pax5表达参与轴突导向、神经递质调控和神经粘附，这些对强大的细胞通讯至关重要。进一步结果表明，Pax5耗竭破坏了NE样细胞中神经突介导的细胞通讯，并减少表面生长因子受体激活，从而提高对多西紫杉醇治疗的敏感性。t-NEPC特异性Pax5启动子CpG岛的羟甲基化有利于Pbx1结合，从而诱导Pax5表达。基于此研究可以得出结论，持续暴露于ARSI疗法会导致t-NEPC中Pax5激活的表观遗传修饰，促进采用耐紫杉醇NE样癌症所需的基因表达。因此，靶向Pax5轴可能有助于恢复其紫杉醇敏感性。
研究方法：
- 利用公开的患者RNA-Seq数据进行分析。
- 在NE样细胞系模型中进行ATAC-Seq、乙酰化组蛋白ChIP-seq和RNA-seq。
- 通过转录因子结合位点分析、基因集富集分析（GSEA）和基因本体（GO）分析等生物信息学方法进行数据解析。
- 通过实验操作，如siRNA干扰、过表达质粒转染等，研究Pax5在细胞中的功能。
结果图形
（1）NE样转化适应特异性基因特征
图1：神经内分泌分化携带神经元特征。
A. C4-2BER细胞与C4-2B细胞之间的RNA表达差异。
B. 对腺癌（C4-2B和C4-2，每组三个重复）和神经内分泌样（NE样）细胞（C4-2BER和DKD，每组三个重复）之间的基因表达进行比较研究。I型基因集代表由REST抑制因子调控的基因，II型表示参与神经内分泌途径的转录调节因子。所有这些细胞系的RNA表达分析在RNA-seq之后进行。
C. 在类似的腺癌和神经内分泌细胞系中对雄激素受体（AR）调控的基因进行比较分析。
D. 维恩图表示两种不同的神经内分泌样细胞系中共同差异表达的基因。
E. 使用共有差异富集的基因集，使用gProfiler进行通路分析。BP代表生物学通路，MF代表分子通路。散点图表示与神经内分泌转化相关的差异化富集通路。
（2）染色质可及性和组蛋白乙酰化增加，在NE样转化过程中诱导转录激活
图2：神经内分泌分化中的染色质可及性差异。
A. 热图显示C4-2B和C4-2BER中差异上调基因的ATAC-Seq信号比较。
B. 热图显示C4-2B和C4-2BER中差异下调基因的ATAC-Seq信号比较。
C. IGV浏览器显示C4-2B和C4-2BER中Hox A基因位点的差异ATAC seq信号。
D. 免疫印迹显示C4-2B和C4-2BER中H3K9、H3K18和H3K27组蛋白乙酰化水平。
E. 热图显示C4-2B和C4-2BER中差异活跃位点H3K27ac和H3K18ac的ChIP-Seq信号比较。
F. 维恩图显示C4-2BER ATAC-seq峰值上发生的差异化ChIP-Seq（H3K18ac和H3K27ac）峰值重叠。
G. 图2F的差异活跃染色质位点附近的基因的RNA-seq表达水平（TPM）。
（3）神经内分泌转分化后Pax5表达增加
图3：新可接近启动子附近的转录因子结合差异。
A. 热图显示A. C4-2B和C4-2BER细胞（N=3）中的转录因子表达。
B. C4-2和DKD细胞（N=3）。
C-D. RT-PCR显示C4-2与DKD以及C4-2B与C4-2BER细胞中Pax5、ETV5、FOXC1、ETS2、KLF12、ELF3的相对基因表达。
E. 图像显示与由TOMTOM确定的Pax5 motif相比，在差异活跃位点识别的motif。
图4：Pax5在不同细胞类型中的表达。
A. 免疫印迹图显示C4-2、C4-2B、C4-2BER、DKD和NCI-H660中Pax5的比较表达，HSC70为对照。（n=3）。
B. RT-PCR显示C4-2B和C4-2BAR细胞中Pax5的RNA表达。
C. 从小鼠细胞系中耗竭RB1后Pax5表达。
D. 在LuCaP TMA中对Pax5进行染色。代表性的IHC染色显示了Pax5在腺癌、CRPC和NE样癌症中的表达。
E. 在转移性前列腺TMA中对Pax5进行染色。图中显示IHC检测的Pax5表达。
（4）Pax5 参与神经元通路相关基因表达谱
图5：Pax5在NE样细胞中调控多种与神经相关通路。
A. 在Pax5耗竭后，C4-2BER和DKD中Pax5调控的重要神经通路基因表达热图。
B. 使用在Pax5耗竭后NE样细胞中差异调控的Pax5基因进行GSEA通路分析。
C-D. 在NE样细胞C4-2BER和DKD中，通过siRNA短暂耗竭Pax5后，验证Pax5调控的基因集。
E-F. 在NE样细胞（DKD）中，通过多西环素诱导的两个独立shRNA短暂耗竭Pax5后，验证Pax5调控的基因集。
G. ChIP-qPCR显示与阴性对照PGM5（两组引物P1和P2）和IgG相比，Pax5调控基因富集情况。
（5）Pax5耗竭增强了多西他赛在t-NEPC中的治疗效果。
图6：Pax5耗竭影响细胞通讯并增强治疗效果。
A-E. 免疫荧光图像显示在Pax5耗竭后，DKD和C4-2BER细胞表面NCAM1表达情况，耗竭方法包括siRNA或shRNA（多西环素诱导，shRNA表达以红色荧光显示）或在Pax5敲低细胞中异位表达Pax5。
F. 超级图表代表在Pax5耗竭和Pax5过表达下，C4-2BER和DKD中类神经突数量的定量分析。
G. 在DKD中，在对照和Pax5耗竭条件下，免疫印迹显示生物素拉下样本中NCAM1表达。也显示了对照和Pax5耗竭下的总蛋白。
H-K. 在有或没有Pax5情况下，通过丙碘铵染色在DKD和C4-2BER细胞中分别定量化疗应激下的细胞活力。
L-M. 免疫荧光图像显示在DKD和C4-2BER细胞中有或没有Pax5情况下，磷脂酰肌醇激酶（p-AKT S-473）表面染色（DKD为品红色，C4-2BER为绿色）；条形图显示定量。
N. 在DKD中，在对照和Pax5敲低条件下，免疫印迹显示p-AKT 473和总AKT的表达。
O. 在DKD中，在对照和Pax5敲低条件下，免疫印迹显示p-EGFR与总EGFR的表达。
（6）Pbx1调控NE样前列腺癌中Pax5表达
图7：Pbx1调控Pax5。
A. C4-2B和C4-2BER细胞中Pax5启动子附近的ATAC-seq和H3K18/H3K27乙酰化ChIP-seq信号。
B. DKD与C4-2以及C4-2BER与C4-2B中Pbx1的表达。
C. 腺癌和NE样细胞中Pbx1表达的免疫印迹。
D-E. 在DKD和C4-2BER细胞中Pbx1耗竭后Pax5表达的RT-PCR分析。
F. C4-2BER细胞中Pbx1耗竭后Pax5表达的免疫印迹。
G. 使用设计在Pax5启动子上游的引物进行Pbx1 ChIP-qPCR。
H. DKD和C4-2细胞中Pax5基因的Epic甲基化芯片分析示意图。绿色三角形代表位于CpG岛的区域。放大了两细胞系近端启动子的胞嘧啶甲基化状态，并显示了每个区域的甲基化状态。红色代表甲基化/修饰的胞嘧啶，绿色是去甲基化胞嘧啶。Pbx1在启动子结合位点由箭头表示。
I. 各种前列腺癌细胞系中TET2表达的免疫印迹。
J. Pbx1结合位点的Pax5启动子区域通过ChIP-qPCR分析了5hmC足迹标记。
K. DKD细胞用Bobcat339（50μM，18-24小时）处理后进行5hmC和Pbx1 ChIP-qPCR，并与未处理的对照样本比较。
L. 对DKD细胞用5-Azacytidine（0.1μM，5-7天）和Bobcat339处理后，进行RT-PCR分析Pax5基因表达。
M. 在t-NEPC维持中Pbx1/Pax5调控的整体示意图。
易基因染色质可及性-转座酶易接近染色质测序（ATAC-seq）
ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing）是通过使用高通量测序对转座酶可接近性核染色质区域进行分析的一种创新表观遗传学研究技术。该技术通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割，进而获得在该特定时空下基因组中所有活跃转录的调控序列。
真核生物的DNA并不是裸露的，而是被包装成核小体形成串珠状结构并进一步被折叠、包装。而基因的转录，需要将这种高级结构解开，使DNA成为可以使各种转录机器与其结合的裸露状态，即形成开放染色质区域。如何鉴定开放染色质区域呢？传统的方法主要是借助和DNase-Seq、MNase-Seq及ChIP-seq。但这些方法需要的起始细胞量较大，对于少量样本和珍稀样本可行性不高。ATAC-Seq是一种新型的研究开放染色质的技术，利用Tn5转座酶进入并切割裸露的DNA，并同时连接上特异性的测序接头。因为切割和加接头一步完成，因此该技术可大大降低所需细胞起始量。
技术优势：
（1）所需细胞起始量低。
（2）应用范围广，适用于大部分物种及细胞类型。
实验策略：
信息分析：
关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。
DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。
应用方向：
ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位
- 转录因子和辅因子结合作用
- 复制因子和 DNA 修复蛋白
- 组蛋白修饰和变异组蛋白
技术优势：
- 物种范围广：细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集经验；
- 微量建库：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析；
- 方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体。
技术路线：
易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。
参考文献：
Bhattacharya S, Harris HL, Islam R, Bodas S, Polavaram N, Mishra J, Das D, Seshacharyulu P, Kalluchi A, Pal A, Kohli M, Lele SM, Muders M, Batra SK, Ghosh PM, Datta K, Rowley MJ, Dutta S. Understanding the function of Pax5 in development of docetaxel-resistant neuroendocrine-like prostate cancers. Cell Death Dis. 2024 Aug 25;15(8):617. pii: 10.1038/s41419-024-06916-y. doi: 10.1038/s41419-024-06916-y. PubMed PMID: 39183332.
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