贝类包纳米虫病诊断方法

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242 g

57.1 mL

100 mL

1000 mL

A.9 电泳缓冲液

50×电泳缓冲液

加水定容至

室温贮存。

A.10 苏木精染液的配制方法

苏木精

无水乙醇

硫酸铝钾

蒸馏水

氧化汞

冰乙酸

20 mL

1000 mL

1g

10 mL

20 g

200 mL 0.5 g

8 mL

分别用无水乙醇溶解苏木精,蒸馏水加热溶解硫酸铝钾,然后两液混合并煮沸,加入氧化汞,继续加

热和搅拌至溶液为深紫色,立即用冰水冷却,恢复至室温后过滤备用。

A.11 伊红染液的配制

选用水溶性伊红。配方为:伊红1g、70%~75% 酒精100 mL、
伊红用少许蒸馏水调成耀糊状,再加
入酒精,边加边搅拌,直至彻底溶解,此时试剂有些浑浊,取0.1 mL
冰乙酸,加入试剂中,试剂逐渐转变

为清亮,呈鲜红色。

A.12 返蓝液的配制

取 5 mL 氢氧化氨,加入1000 mL 蒸馏水中即可。

A.13 石蜡切片制备

A.13.1 组织脱水、透明、浸蜡、包埋、切片

取材固定24 h,修整组织块,换固定液重新固定12 h, 自来水冲洗24 h、70% 乙 醇
1 h、85% 乙醇 1h、95% 乙醇45 min 2 次,无水乙醇30 min3 次,二甲苯30
min,二甲苯5 min~20 min 2 次,放入石蜡

1h~1.5h2 次,然后包埋,并修片,切片,展片,贴片,烤片。

A.13.2 切片水化、染色、水洗、脱水、复染及封片

二甲苯10 min 2
次,然后依次通过无水乙醇、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各2
min,再

GB/T 42821—2023

通过蒸馏水3min 后,苏木精染色5 min~20 min,自来水洗3 min,1% 盐酸酒精8
s~15 s,自来水洗 3 min后,返蓝液2 min~5 min,自来水5 min,蒸馏水5
min,然后依次通过50%乙醇、70%乙醇、80% 乙醇各3 min
进行脱水,0.5%伊红染液复染1 min~2min,
再依次通过95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇、

无水乙醇各2 min 进行二次脱水,二甲苯透明2 min 2次,最后用封片树胶封片。

GB/T 42821—2023

B

(资料性)

贝类包纳米虫病

B.1 疾病描述

包纳米虫病是由牡蛎包纳米虫(Bonamia ostreae)、杀蛎包纳米虫(Bonamia
exitiosa)等在宿主血
细胞内寄生或者游离在结缔组织、鳃、内脏或外套膜中而引起的水生动物的一种血液原虫病,是严重危

害世界贝类养殖业的主要疾病,也是世界动物卫生组织(WOAH)
规定的检疫性贝类寄生虫病。

B.2 病原

现发现的包纳米虫包括5个种,除主要寄生在欧洲平牡蛎(Ostrea
edulis)体内的牡蛎包纳米虫 (Bonamia
ostreae)外,还有寄生在悉尼岩牡蛎(Saccostrea
glomerata)体内的鲁夫来包纳米虫 (Bonamia roughleyi)、欧洲平牡蛎(Ostrea
edulis)体内的杀蛎包纳米虫(Bonamia exitiosa)、近江牡蛎 (Crassostrea
ariakensis)体内的成孢包纳米虫(Bonamia
perspora)、澳大利亚安加西牡蛎(Ostrea an-
gasi)体内的包纳米虫未定种(Bonamia
sp.)。该病原的感染力较强,含有该病原的悬液具有传染性,使
其在寄主细胞内定位接触30 min
即可感染牡蛎,其中以颗粒血细胞中的病原感染力最强。造成广泛危

害的主要为牡蛎包纳米虫和杀蛎包纳米虫。

B.3 易感宿主

易感宿主包括欧洲平牡蛎(Ostrea edulis)、安加西牡蛎(Ostrea
angasi)、帕尔希牡蛎(Ostrea puel- chana)、 智利牡蛎(Ostrea
chilensis)、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)、智利鹑螺(Tiostrea
chilensis)

等贝类。

B.4 临床症状

牡蛎感染包纳米虫病后通常表现为双壳闭合不全,严重时出现鳃丝损伤或死亡,但该症状也可能由

其他疫病引起,并不能通过症状来判定是否感染了包纳米虫病。轻症则无明显症状。

B.5 地理分布

本病主要分布在丹麦、荷兰、法国、爱尔兰、英国、意大利、西班牙、美国。欧洲和南美洲都曾有牡蛎
包纳米虫感染欧洲平牡蛎引起死亡的报道。近十几年来,牡蛎包纳米虫病的流行趋于缓和,虽未出现重
大的流行,但在美国、英国、爱尔兰、加拿大等地时有发生,流行率从百分之零点几到百分之三四十不等。

我国目前尚未有水生动物包纳米虫病发生的报道。

B.6 组织印片检查

包纳米虫呈球形或卵圆形,虫体大小为2μm~5μm,
细胞核红染,细胞质蓝染,多寄生在细胞内。

包纳米虫见图 B.1 中箭头所指位置。

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B.1 组织细胞内的包纳米虫

B.7 血淋巴印片检查

在显微镜下可观察到虫体寄生于血淋巴细胞内,呈球形或卵圆形,大小为2μm~5μm,
姬姆萨染

色后,细胞核红染,细胞质蓝染。包纳米虫见图 B.2 中箭头所指位置。

B.2 牡蛎血液中的包纳米虫

B.8 组织病理学检查

包纳米虫呈球形或卵圆形,虫体大小为2μm~5μm,
细胞核红染,细胞质蓝染。包纳米虫见图 B.3

中箭头所指的位置。

GB/T 42821—2023

B.3 牡蛎石蜡切片中包纳米虫的观察

GB/T 42821—2023

附 录 C

( 资 料 性 )

目标扩增序列及引物 、 探针的位置

C.1 Bonamia ostreae 的 PCR 目 标 扩 增 序 列 及 引 物 位 置 ( 3 0 0 bp)

CATTTAATTGGTCGGGCCGCTGGTCCTGATCCTTTACTTTGAGAAAATTAAAGTGCTCAAA

Bon F

GCAGGCTCGCGCCTGAATGCATTAGCATGG’AATAATAAGACACGACTTCGGC|GCICGCCT|CGGC
G

GTTGTTTTGTTGGTTTTGAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAACAATTGGGGGTGCTAGTA

TCGCCGGGCCAGAGGTAAAATTCTTTAATTCCGGTGAGACTAACTTATGCGAAAGCATTC

ACCAAGCGTGTTTTCTTTAATCAAGAACTAAAGTT GGGGGATCGAAGACGATCAG

Bon R

注:斜体带下划线的GGCGCC 为 Hae Ⅱ 酶切位点,“口”中的GCCGCCTCGGC
为 Bgl I 酶切位点,“ | ”表示酶切位 点的酶切位置。对特异性引物 Bon F
和 Bon R 的 PCR 扩增产物进行 Hae Ⅱ 和 Bgl I 酶切分析,Bonamia os-

treae 、Bonamia exitiosa 和 Bonamia perspora 被限制性内切酶 Hae Ⅱ
酶切为115 bp 和189 bp;Bonamia

ostreae 被限制性内切酶 BglI 酶切为120 bp 和180 bp,Bonamia exitiosa 和
Bonamia perspora 不能被酶

切,以此确定其种属。

C.2 Bonamia exitiosa 的 PCR 目 标 扩 增 序 列 及 引 物 位 置 ( 3 0 4
bp)

CATTTAATTGGTCGGGCCGCTGGTCCTGATCCTTTACTTTGAGAAAATTAAAGTGCTC

Bon F

AAAGCAGGCTCGCGCCTGAATGCATTAGCATGGAATAATAAGACACGACTTCGGCGC|CGC

CTCTCGTGGC GGTTGTTTTGTTGGTTTTGAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAACAATTGG

GGGTGCTAGTATCGCCGGGCCAGAGGTAAAATTCTTTAATTCCGGTGAGACTAACTTATG

CGAAAGCATTCACCAAGCGTGTTTTCTTTAATCAAGAACTAAAGTT GGGGGATCGAAGACGATCAG

Bon R

C.3 荧 光 PCR 的 目 标 扩 增 序 列 及 引 物 探 针 位 置 ( 9 2 bp)

GAGCTGGAGTAATGATTGATAGAAACAATTG
GGGGTGCTAGTATCGCCGGGCCAGAGGTA

Bon qF Bon qP

AAAT TCTTTAATTCCGGTGAGACTAACTTATG

Bon qR

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